*各個(ge) 科研大國的腦計劃，起因於(yu) 人們(men) 對行為(wei) 及大腦探秘的高度關(guan) 注。Nature不久前的一篇報道闡述到，中國腦科學研究所於(yu) 2018年3月22日正式在北京成立，中國腦計劃實體(ti) 店終開，北京大學饒毅與(yu) NIBS北京生命科學研究所羅敏敏共同主管。此舉(ju) 也是繼2013年歐美的腦計劃、日本2014年的類似小的項目、韓國2016年後中國的跟進。北京市政府資助1.8億(yi) 人民幣，五年內(nei) 招募約5-6個(ge) 課題組約50名研究者，之後希望借助腦計劃每年大約需4億(yi) 人民幣。不難看出，對大腦的研究是一個(ge) 極其重要而艱難的任務，任重道遠，需要相關(guan) 領域科研工作者貢獻自己的才智、見識與(yu) 勤勉。本文接下來是對學習(xi) 與(yu) 記憶機製研究的相關(guan) 文章進行解讀與(yu) 闡釋。

TRPM7在不同發育階段對維持正常突觸密度以及學習記憶是*的

在複旦大學腦科學研究院、醫學神經生物學國家重點實驗室研究員那德（Nashat Abumaria）課題組的努力下，其研究成果發表在Cell Reports的封麵上，影響因子IF為(wei) 8.032，鑒於(yu) 榮登封麵，價(jia) 值高於(yu) 影響因子。

文章關(guan) 注的是一種通道酶TRPM7，因為(wei) 它在很多組織都有，這裏關(guan) 注的是它在CNS中樞神經係統並且是生理情況下非病理情況下的功能與(yu) 角色,確切的是海馬區的神經元Knockdown敲低以後發現突觸密度減少，但這一現象可以通過C端激酶區得到挽救，挽救的機製可能是磷酸化下遊的cofilin蛋白(Cofilin是普遍存在於(yu) 真核細胞的一種肌動蛋白結合蛋白.Cofilin的基本功能是在細胞內(nei) 結合和解聚F肌動蛋白)；出生後小鼠knockout敲除以後損傷(shang) 了學習(xi) 記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性，成年大鼠海馬區knockdown以後也損傷(shang) 了學習(xi) 記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性；

為(wei) 了研究這個(ge) 通道酶對學習(xi) 與(yu) 記憶的影響，文章選取了小鼠與(yu) 大鼠這兩(liang) 種模式動物，為(wei) 了細致觀察這種通道酶的功能，做了Knockdown敲低（針對成年大鼠）以及Knockout敲除（針對出生後小鼠）這兩(liang) 種處理方式，輔以挽救實驗即在Knockout敲除的小鼠大腦內(nei) 又注射回該酶以觀察效果（針對小鼠，並針對該酶的部分區域即激酶區域），對於(yu) 主要的衡量指標包括突觸密度、突觸可塑性以及學習(xi) 與(yu) 記憶行為(wei) ，前兩(liang) 種的衡量方法屬於(yu) 比較常規的抗體(ti) 染色顯微成像、體(ti) 外電生理記錄，後一種課題組采用了荷蘭(lan) 諾達思全新的Cognition Wall認知牆工具評判學習(xi) 與(yu) 記憶行為(wei) ，值得關(guan) 注。後麵會(hui) 具體(ti) 談到。

1、體外細胞層麵

首先體(ti) 外情況如何，在細胞層麵，Knockdown敲低TRPM7的表達，看看海馬體(ti) 神經元的情況，當然敲除後表達量減少了並且不影響其它蛋白的表達並且不影響神經元的生長，另外關(guan) 鍵的發現突觸密度顯著減少，突觸素等也顯著下降! 

上圖左邊是對照組，右邊是敲低後的實驗組，可以看出各種重要染色顯示敲低後突觸密度、突觸素顯著下降。上麵的諸多敲低後的結果到底是什麽(me) 在起作用，於(yu) 是展開挽救實驗，提高鎂離子和鋅離子濃度，不行，甚至發現後來兩(liang) 者的細胞內(nei) 濃度與(yu) TRPM7無關(guan) 了，看來非離子通道在突觸密度減少起作用；後來加入C端激酶區域，發現突觸密度顯著提高！

上麵六張熒光圖，第二張即是加入C端激酶區域，發現突觸密度顯著提高，而第三張是突變了的C端激酶發現就不能提高，其特異性可見！

2、動物模型層麵

進入到小鼠與(yu) 大鼠的動物階段！

采用特定knockout的小鼠，大腦特定區域基因敲除了TRPM7看看實際的個(ge) 體(ti) 層麵的情況，檢查一些基本的行為(wei) 參數比如運動活性、探索新物體(ti) 的動機，這些都是正常的。新物體(ti) 識別的認知參數，敲掉後小鼠明顯下降。學習(xi) 認知實驗中，敲除後的小鼠明顯學習(xi) 能力下降，隻有40%的小鼠學會(hui) 了認知牆實驗，學習(xi) 階段獲取了更少的顆粒獎勵，記憶階段更少地做出了正確的選擇。而且CA1區域(海馬體(ti) 的一個(ge) 區域)的突觸密度也顯著下降。並且突觸前末端密度減少、突觸後場興(xing) 奮電位下降，這些都表明基因敲除的小鼠突觸的可塑性受損了。

圖1：

圖2：

圖1左邊是黑色的是對照組的突觸密度，右邊黑色的是敲除組的突觸密度，明顯下降！圖2測定的是場興(xing) 奮性突觸後電位，黑色的是對照組的LTP長時程增強，紅色的是敲除組的LTP長時程增強，明顯突出的可塑性受損！

這些突觸密度的下降、突觸可塑性的受損，反應到行為(wei) 學上則是學習(xi) 認知的問題。

采用荷蘭諾達思的Cognition Wall認知牆工具進行學習認知行為的研究  

Cognition Wall認知牆工具包含EthoVision軟件係統以及PhenoTyper小鼠家居箱以及三孔認知牆等。動物從(cong) 特定的入口進入（上圖顯示綠色的入口），則軟件自動給予食物獎勵（上圖藍色的顆粒顯示）該實驗全程自動，不需要人為(wei) 幹預，軟件自動控製硬件並自動記錄數據並自動分析數據。

實驗如下：

實驗前一周小鼠在標準的鼠籠單籠飼養(yang) ；

• 實驗開始前11個小時前將小鼠放入小鼠家居箱，讓其適應環境，即大約晚上8:30將小鼠放入，可以進水限製進食；
• 這個適應階段放入10粒食物，使小鼠能找到食物給予的地方
• 早上7:30放入認知牆，早上8:00開始實驗，全程自動進行；
• 這個過程小鼠需要連續進入左邊的孔5次則軟件自動控製硬件給予一粒食物（即上圖綠色的孔）。

Tip: 本文的小鼠節律是晚上8點開燈至第二天早上8點關(guan) 燈，後期采用紅色昏暗的燈光作為(wei) 晚上時間，即light phase 8:00pm-8:00am dark phase 8:00am-8:00pm其中dark phase為(wei) 實驗進行時段。

以下圖示為(wei) 實驗結果：

從(cong) 從(cong) 結果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠隻有40%的學會(hui) 了認知牆！對照組全部學會(hui) ！對比明顯！在一天後的記憶測試階段，將小鼠重新放回帶有認知牆的家居箱，在1個(ge) 小時的測試中計算小鼠做出正確選擇的比例（即從(cong) 左邊孔進入）。

從(cong) 結果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠做出正確選擇的比例明顯低於(yu) 對照組。

為(wei) 了確保食物獎勵的裝置沒有問題，實驗者亦手動數了每隻小鼠在學習(xi) 過程中獲得的食物獎勵的數目，因為(wei) 食物獎勵的數目與(yu) 小鼠的學習(xi) 能力是相關(guan) 的。

明顯，基因敲除的小鼠獲取食物獎勵的數目少於(yu) 對照組，學習(xi) 能力明顯弱於(yu) 對照組。

沒有完！在小鼠模型上注射C端激酶的病毒進行挽救實驗，對照組、激酶組、突變激酶組，一個(ge) 月後做行為(wei) 學測試後處死進一步分析，新物體(ti) 識別的認知參數，對照組和激酶組都明顯高於(yu) 突變激酶組。學習(xi) 認知實驗中，對照組和激酶組都明顯學習(xi) 得更快，記憶測試也更多地做出了正確的選擇。當然突觸密度與(yu) 突觸可塑性均高於(yu) 突變組。

這和開始的細胞實驗對應了起來，在動物模型上並且是行為(wei) 實驗上驗證了C端激酶對學習(xi) 記憶的關(guan) 鍵作用。

當然以大鼠為(wei) 模型，在特定knockdown的大鼠，確定敲低其表達以後，同樣基本的行為(wei) 參數是沒有差異的，後測定大鼠的學習(xi) 與(yu) 記憶能力，T迷宮空間學習(xi) 實驗（敲低後做出正確選擇的比例明顯下降）、短期再認記憶（過去經驗或識記過的事物再次呈現在麵前時仍能確認和辨認出來的過程）也受損、背景記憶也受損，當然突觸密度與(yu) 突觸可塑性均明顯下降 。

後一個(ge) 話題，文獻報道過cofilin參與(yu) 的一些功能和TRPM7敲除後很類似，提出假設在學習(xi) 認知層麵TRPM7可能借助cofilin參與(yu) 了下遊的機製，發現敲除後cofilin磷酸化（抑製）顯著減少，而激酶組的cofilin確實磷酸化得到了恢複，並驗證了兩(liang) 者是直接結合的。

當然下遊這塊研究還是比較簡單，偏向於(yu) 現象的關(guan) 聯，未能直接與(yu) 學習(xi) 記憶做深入研究。另外，激酶的功能是通過突觸前、突觸後來調控突觸密度的機製也需要進一步闡明。

海馬體(ti) （左）與(yu) 海馬（右）

參考文獻：

Liu YQ#,Chen C# ,Liu YL#,Li W, Wang ZH,Sun QF,Zhou H,Chen XJ,Yu YC,Wang Y, Nashat Abumaria*. (2018) TRPM7 Is Required for Normal Synapse Density, Learning, and Memory at Different Developmental Stages .Cell Reports.23(12):3480–3491

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