帕金森病 (PD) 是最常見的運動障礙，全球約 500 萬(wan) 人患有帕金森病。這種神經退行性疾病的特征包括運動遲緩、靜止性震顫、姿勢不穩和肌肉僵硬。雖然我們(men) 仍未*了解PD的原因，但黑質中多巴胺能神經元的退化是該疾病的主要病理特征。目前的藥物療法，例如L-dopa、多巴胺激動劑、單胺氧化酶等，通過更換多巴胺或控製其新陳代謝來進行對症治療。雖然這些藥物大大提高了病人的生活質量，但它們(men) 會(hui) 隨著病情的發展逐漸失去功效，還會(hui) 出現由L-dopa引起的運動波動和運動障礙。盡管大量新的抗帕金森的候選藥物在臨(lin) 床前研究中取得初步成功，我們(men) 對於(yu) 開發新的替代藥物的需求依舊不斷增長。
斑馬魚因為(wei) 體(ti) 積小、透明度高、對化合物的滲透性高，特別適合大規模藥物篩選。此外，研究表明斑馬魚多巴胺能係統的組織和功能與(yu) 哺乳脊椎動物相比更加穩定，這使得斑馬魚成為(wei) 一種實用且經濟的用於(yu) 測試神經活性化合物作用的動物模型。當斑馬魚幼魚被6-OHDA (6-羥基多巴胺) 影響後，會(hui) 展現出典型的PD表型特征，即多巴胺能神經元的死亡和運動遲緩。此外，6-OHDA 損傷(shang) 的斑馬魚對抗帕金森病化合物有反應，因此斑馬魚模型是有效的評估新療法的工具。
為(wei) 緩解6-OHDA損傷(shang) 的斑馬魚幼魚的運動障礙以及神經細胞數量減少的症狀，本次實驗主要探究三種抗帕金森症的化合物L-dopa, rasagiline 和 isradipine的作用。我們(men) 最終選用了stavudine, tapentadol 和 nabumetone作為(wei) 帕金森症的靶向藥。接下來和我們(men) 一起來了解實驗過程和研究結果吧。
過程
本次實驗針對測試治療控製進行了優(you) 化，使用了如圖1所示的劑量反應曲線，將斑馬魚幼魚在受精後在胚胎培養(yang) 基內(nei) 長大至第四天，胚胎培養(yang) 基包含（EM [5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、 0.33 mM MgSO4, pH 7.4]) 以及 1 μM 亞(ya) 甲基。
在這個(ge) 發育階段，斑馬魚兒(er) 茶素層能係統已*發育，血腦屏障 (BBB) 也已經開始發揮作用。斑馬魚幼魚在受精後的五天內(nei) 都處於(yu) 6-OHDA 誘導的多巴胺能損傷(shang) 環境中，讓神經毒素*滲透於(yu) 血腦屏障。
在第六天根據實驗分組，不同的化合物會(hui) 加入到幼魚的培養(yang) 基液中並持續24小時。我們(men) 通過使用諾達思的斑馬魚行為(wei) 軌跡跟蹤係統(DanioVision)來記錄幼魚的自發運動行為(wei) ，斑馬魚行為(wei) 軌跡跟蹤係統可以自動跟蹤斑馬魚用於(yu) 的行為(wei) 及運動軌跡。幼魚可以在96孔板中自由遊動，在10分鍾的晝夜循環後會(hui) 進行90分鍾的跟蹤記錄。記錄下的運動軌跡數據通過諾達思的動物運動軌跡跟蹤係統(EthoVision XT)進行分析，並且隻分析在黑暗期間的遊泳行為(wei) 。根據諾達思提供的實驗規章，實驗所測量和分析的數據包括總遊動距離(mm)、突發遊泳行為(wei) (遊動速度大於(yu) 25mm/s的次數) 和靜止狀態。
圖1
結果
結果1
L-dopa, rasagiline 和 isradipine可緩解斑馬魚幼魚運動遲緩
6-OHDA損傷(shang) 的斑馬魚幼魚從(cong) 移動總距離的量化上表現出類似運動遲緩的行為(wei) ，為(wei) 了進一步表現這種運動損傷(shang) ，我們(men) 計算了幼魚達到逃跑行為(wei) 的速度次數(>25mm/s)。這個(ge) 參數可以評估運動適應性。在暴露於(yu) 6-OHDA兩(liang) 天後受損幼魚與(yu) 健康幼魚比，爆發遊動和總移動距離都減少了(圖2)。我們(men) 還評估了在這個(ge) 模型中L-dopa能否緩解運動損傷(shang) ，為(wei) 了確定有效劑量，將6-OHDA損傷(shang) 的幼魚與(yu) 不同濃度的每種化合物進行接觸幹預，並勾勒出了劑量反應圖。如圖2。
圖2
結果2
Isradipine可以緩解多巴胺能細胞數量的減少
我們(men) 還探索了L-dopa, rasagiline和isradipine對神經元損失緩解的特性。在用每種化合物以有效劑量幹預幼魚後，分析幼魚行為(wei) ，結果如圖3所示。Isradipine可以緩解6-OHDA損傷(shang) 的幼魚多巴胺能細胞數量的減少。相反L-dopa和rasagiline並未在斑馬魚模型中呈現改善疾病的效果。
圖3
結果3
Isradipine 和 amantadine可以減少幼魚的運動障礙樣行為(wei)
同樣通過每種化合物以有效劑量幹預幼魚後，分析幼魚行為(wei) 得出，isradipine在0.06μM劑量和amantadine在25 μM劑量時，幼魚的運動障礙樣行為(wei) 有所緩解。相反L-dopa則未起到作用，如圖4。
圖4
結果4
通過基於(yu) 表型的篩選來識別具有抗帕金森病潛能的化合物
為(wei) 了篩選出可以針對帕金森症緩解運動障礙的化合物，我們(men) 對1600種FDA認證的藥品進行了表型測定。1600種FDA認證的藥物中有258 (16%)種藥品在第一輪實驗分析中可以緩解運動障礙 (Fig.5 Table1)，基於(yu) 預先確定的排除標準再將這些藥物重新定位進行篩選，83 種(32%)藥品被淘汰(Table2)。在第三輪和第四輪的篩選中，有78種(30%)和23種(29%)藥品可以相對來說緩解運動障礙(Table 1)。在經過最後的分析之後，最終確定了三種：stavudine, tapentadol 和 nabumetone，作為(wei) *的可以用於(yu) 未來研究抗帕金森靶向藥的藥品(Table 3)。
圖5
參考文獻
Vaz, Rita L., et al. “Identification of Antiparkinsonian Drugs in the 6-Hydroxydopamine Zebrafish Model." Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 189, 2020, p. 172828.
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