呼吸是維持所有動物身體(ti) 機能的重要組成部分。因此，當氧氣穩定狀態被破壞時，身體(ti) 往往會(hui) 通過調整呼吸參數來做出反應。然而，在斑馬魚胚胎或幼魚等小型生物中，客觀地測量呼吸運動已被證明是困難的。
本文將探討海德堡大學的研究人員對我們(men) 的產(chan) 品斑馬魚微視行為(wei) 分析係統的新穎應用。Nadine Kämmer和她的同事使用斑馬魚微視行為(wei) 分析係統客觀地測量斑馬魚的呼吸運動，並將這種方法與(yu) 手動評估進行了比較[1]。

為(wei) 什麽(me) 不手動測量呼吸？
維持氧氣穩態非常重要，因為(wei) 氧氣是通過產(chan) 生有氧能量以維持細胞代謝所必需的。當暴露在低氧環境（缺氧）中時，魚類往往會(hui) 增加呼吸動作，以增強氧氣提取。相反，當暴露在高氧環境（高氧）中時，他們(men) 會(hui) 通過減少呼吸來節省能量，這也可以防止過量的氧氣攝入，從(cong) 而防止氧化應激。然而，這種呼吸頻率降低的潛在負麵影響是血液中二氧化碳的積聚，導致酸中毒。
由此我們(men) 可以得出，呼吸是魚類對環境生理反應的良好指標。然而，手動計算斑馬魚的呼吸既耗時，又不可靠。可靠性問題在一定程度上使人工計數在現代科學時代變得不可行。


缺乏良好的客觀方法
雖然客觀的衡量標準確實存在，但對於(yu) 大多數研究來說，它們(men) 並不是最佳的。將電極連接到鰓蓋（為(wei) 鰓提供結構支撐和保護的骨骼）進行了研究。然而，這種方法非常具有侵入性，隻適用於(yu) 較大的魚類，而不適用於(yu) 胚胎和幼魚。
電極也以非侵入性的方式被用於(yu) 檢測由生物電信號介導的水電導率的變化。然而，由於(yu) 魚胚胎的大小，它們(men) 的身體(ti) 運動會(hui) 幹擾呼吸運動的檢測，因此不適合對魚胚胎進行研究。

每一次呼吸，都會(hui) 測量
Nadine Kämmer和她的同事著手解決(jue) 這個(ge) 問題。為(wei) 了比較斑馬魚不同生命階段的呼吸運動和反應，對4天大的斑馬魚胚胎和12天大的幼魚進行了測量。魚類短期暴露於(yu) （1小時）水中不同濃度的lindane（引起呼吸壓力的神經毒性農(nong) 藥）、溶劑對照組中。
視頻記錄是在魚胚胎被麻醉的同時進行的，以防止身體(ti) 運動幹擾測量。將魚轉移到凝膠袋中後，對其進行2分鍾的馴化，然後在顯微鏡下以每秒25幀的幀速率對魚進行視頻跟蹤。
這些視頻隨後被用於(yu) 手動計數以及斑馬魚微視行為(wei) 分析係統中的分析。人工計數是由兩(liang) 名觀察者通過觀察魚的嘴或蓋來完成的。在這裏，一口氣被定義(yi) 為(wei) 其中一個(ge) 身體(ti) 部位的運動（取決(jue) 於(yu) 魚的方向）。


斑馬魚微視行為(wei) 分析係統的新穎應用
為(wei) 了便於(yu) 客觀測量，使用了Noldus的斑馬魚微視行為(wei) 分析係統。最初，斑馬魚微視行為(wei) 分析係統被設計用於(yu) 自動檢測早期斑馬魚的活動。它可以測量許多參數，如：爆發活動/持續時間、不活動，但也可以測量更具體(ti) 的生理參數，如尾巴卷曲和血液/腸道流量。
由於(yu) 斑馬魚微視行為(wei) 分析係統沒有內(nei) 置的呼吸檢測功能，研究人員必須進行一些前處理和後處理步驟。總之，他們(men) 導入的視頻幀速率必須保持不變，因為(wei) 斑馬魚微視行為(wei) 分析係統無法處理不規則的幀速。然後，必須在程序中繪製感興(xing) 趣的區域，然後為(wei) 本研究優(you) 化檢測設置。關(guan) 於(yu) Kämmer等人采取的確切步驟，請參閱他們(men) 的文章。


接下來該如何做？
一般來說，斑馬魚微視行為(wei) 分析係統的測量顯示，與(yu) 手動計數相比，壓力魚的呼吸頻率要高得多。這可能意味著手動計數可能會(hui) 錯過呼吸動作的情況，尤其是在lindane濃度較高的情況下，當呼吸頻率急劇增加，動作變得快速和不規則時。此外，在這些情況下，人工計數低估了呼吸頻率高達250%。
有了斑馬魚微視行為(wei) 分析係統的這一新應用，研究人員能夠成功測量斑馬魚幼魚和胚胎的呼吸頻率和振幅。這些客觀的測量方法在斑馬魚研究中，特別是在毒理學和藥理學方麵非常有價(jia) 值。它使研究人員能夠看到某些物質和藥物在不同生命階段的影響，而這在以前是不可能的。
Kämmer等人最後表示，雖然使用斑馬魚微視行為(wei) 分析係統進行這一分析需要一些步驟，但這是一個(ge) 值得進一步研究和驗證的有趣課題。此外，手動設置感興(xing) 趣區域也可用於(yu) 檢測斑馬魚的其他小動作，如眼球運動或塑料顆粒通過腸道或鰓。


參考文獻
1. Kämmer, N.; Reimann, T.; Ovcharova, V.; Braunbeck, T. A Novel Automated Method for the Simultaneous Detection of Breathing Frequency and Amplitude in Zebrafish (Danio Rerio) Embryos and Larvae. Aquat. Toxicol. 2023, 258, 106493.


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