對塑料汙染的研究表明，這種威脅對我們(men) 星球的危險程度正在與(yu) 日俱增。海洋是絕大多數塑料垃圾的最終目的地。聚苯乙烯是熱塑性聚合物中使用廣泛的塑料之一，也是環境中觀察到的塑料碎片的主要成分之一，它可用於(yu) 食品服務和食品包裝，因此可以直接包含在食物鏈中。在這項研究中，在胚胎期注射20納米大小的聚苯乙烯顆粒（PS）的斑馬魚在沒有塑料暴露的環境中生長，在形態、分子和代謝組學水平上研究聚苯乙烯顆粒對其後代胚胎/幼魚的影響。

1.材料和方法
1.1斑馬魚飼養(yang) 和PNP處理
試驗中使用斑馬魚，總共300個(ge) 胚胎，每次複製100個(ge) 胚胎，注射聚苯乙烯納米塑料（PNP）。此外，用注射超純水的胚胎作為(wei) 對照組。將注射的和對照的胚胎保存在胚胎培養(yang) 基和28.5度的培養(yang) 箱中直到第6天。從(cong) 第6天開始，幼魚被帶到係統中的特殊幼魚槽中，並用特殊的幼魚飼料喂養(yang) 到第15天。從(cong) 第15天開始，每天給它們(men) 喂食並生長6個(ge) 月。直到6個(ge) 月，注射PNP的斑馬魚的存活率與(yu) 對照組相比沒有觀察到顯著差異。從(cong) 對照組和注射組中隨機選擇10隻雌性和20隻雄性6個(ge) 月大的斑馬魚，將它們(men) 放入繁殖池中，每個(ge) 繁殖池中有2隻雄性和1隻雌性。每組至少獲得700個(ge) 胚胎用於(yu) 每次複製。將後代胚胎取入E3胚胎培養(yang) 基中，觀察至第120小時。每24小時記錄一次所有後代斑馬魚的存活率、孵化率和身體(ti) 異常。

1.2心跳、血流和運動活性測定
對於(yu) 心跳和血流分析，從(cong) 對照組和PNP治療組中隨機選擇10個(ge) 120小時胚胎，在顯微鏡下進行180秒的視頻記錄。視頻聚焦於(yu) 心髒的心跳和尾靜脈的血流，然後轉移到諾達思的斑馬魚微視行為(wei) 分析係統進行分析。所有實驗分三個(ge) 重複進行。對於(yu) 運動活性，從(cong) 對照組和PNP處理組中隨機選擇24隻幼魚，每隻120小時，將其放置在24孔板上，每個(ge) 孔中有一隻幼魚，並將板放置在諾達思的斑馬魚行為(wei) 軌跡跟蹤係統中。在馴化30分鍾後，將該係統調節至10分鍾間隔的黑暗和光明期50分鍾。在分析期間，通過動物運動軌跡跟蹤係統評估幼魚的運動活動。對每組進行三次重複的72隻幼魚進行分析。

1.3全程免疫熒光幼魚染色
為(wei) 了研究親(qin) 代PNP暴露對後代自由基形成、細胞凋亡和脂質積累的影響，將達到120小時的新一代幼魚作為(wei) 整體(ti) 免疫熒光進行分析。

1.4代謝組學
將來自對照組和PNP組的25個(ge) 120hpf胚胎匯集在1ml微量離心管中（每組10個(ge) ）。加入1ml甲醇以維持均化過程。之後，將提取物置於(yu) 水浴中超聲處理約10分鍾。最後，將所有樣品以離心10分鍾。將上清液輕輕轉移到另一個(ge) 微型離心管中，並在真空下抽吸直至幹燥。通過100μl流動相（去離子水：乙腈，包括%0.1甲酸）對樣品進行重組。

2.結果和討論
根據本研究獲得的結果，觀察到與(yu) 對照組相比，親(qin) 代PNP暴露導致下一代幼魚的總體(ti) 畸形（包括心包水腫、卵黃囊水腫、身體(ti) 畸形/彎曲體(ti) 軸）顯著增加（圖1 a和b段）。與(yu) 注射胚胎（父母）相比，在後代幼魚中觀察到的畸形率低於(yu) 在注射幼魚中觀察的畸形率（圖1b段）。同樣，觀察到親(qin) 代PNP暴露會(hui) 增加下一代幼魚的死亡率（圖1c），但考慮到注射的胚胎（親(qin) 代），觀察到下一代幼體(ti) 的存活率高於(yu) 注射PNP的胚胎（父母）。另一方麵，與(yu) 對照組相比，孵化率沒有差異（圖1d）。PNP組的心包區域明顯增加（圖1e）。這種增加支持了觀察到的心包水腫。

圖1

在PNP組中觀察到眼睛大小和身體(ti) 長度顯著減少（圖1f和g）。雖然已經確定親(qin) 代PNP暴露會(hui) 導致後代幼魚的血流量和心率增加，但根據運動活動的結果，觀察到它會(hui) 導致黑暗期的運動減少（圖1h–k）。另一方麵，根據整株免疫熒光幼魚染色結果，親(qin) 代PNP暴露導致下一代幼魚的細胞死亡和自由氧自由基數量增加（圖2）。另一方麵，由於(yu) 脂質代謝的不規則性，檢測到脂質積累顯著減少（圖2）。

圖2

在本研究中，為(wei) 了闡明在胚胎早期暴露於(yu) PNP的斑馬魚後代中觀察到的這些形態學、生理學和分子損傷(shang) 的潛在機製，通過化學計量分析評估Q-TOF MS/MS光譜來進行代謝組分析。在圖中，各組之間存在一定差異（圖3a段）。圖3b中，有兩(liang) 個(ge) 主要集群，發現對照組和PNP組之間存在顯著差異。這些代謝物可能因投影變量（VIP）得分而顯著變化（圖3c段）。在圖3c中，下調和上調的代謝物分別被闡明為(wei) 紅色和藍色。根據分析結果，確定酪氨酸、不飽和脂肪酸代謝、葉酸生物合成和精氨酸-脯氨酸代謝受到嚴(yan) 重影響（圖3d）。

圖3

代謝組結果表明，與(yu) 多巴胺合成密切相關(guan) 的3-甲氧基酪胺（3-MT）和高香草酸（HVA）水平在PNP組中顯著上調（圖3c）。3-MT是多巴胺的主要代謝產(chan) 物，而HVA是多巴胺分解代謝的主要代謝物。兩(liang) 種化合物水平的共同增加表明，這可能是與(yu) RET原癌基因、多發性內(nei) 分泌腫瘤類型、Von Hippel-Lindau和整合膜蛋白相關(guan) 的幾個(ge) 基因發生遺傳(chuan) 突變的跡象。較低的多巴胺水平和誘導分解代謝機製可能導致神經係統疾病。此外，研究表明，多巴胺在腫瘤組織中的濃度低於(yu) 良性組織，甚至通過多巴胺治療可以減少慢性應激介導的血管生成，從(cong) 而阻止腫瘤細胞增殖。

甲基糖胺（creatin），與(yu) 生物體(ti) 內(nei) 的許多過程有關(guan) ，包括生理、神經、免疫和代謝，被確定為(wei) PNP組中具有最高顯著性的上調代謝產(chan) 物（圖3c）。高肌酸水平是腎/肌肉疾病和腎功能障礙的標誌。此外，這種肌肉廢物可能導致血管損傷(shang) 和高血壓。當評估高血流量和心率以及高肌酸水平時（圖1和圖3），我們(men) 可以說父母PNP暴露顯著影響下一代。

為(wei) 了在分子水平上評估這些癌症相關(guan) 代謝物水平的變化，對幼魚進行組織病理學和免疫組織化學（使用JNK、NOP10、PI3和H2A.X生物標誌物）分析，並搜索癌症結果。根據組織病理學結果，在PS組的幼魚中發現了嚴(yan) 重的神經元變性和壞死，特別是在腦組織中，以及血管中具有核多態性的非典型、深染、增生細胞（圖4）。另一方麵，根據免疫組織化學分析結果，在PS組幼魚中檢測到顯著更高的免疫陽性率，特別是在腦組織JNK和H2A.X表達中，以及在血管中檢測到的非典型細胞中NOP10和PI3表達中（圖4）。研究表明，JNK與(yu) 惡性轉化和腫瘤生長有關(guan) 。另一方麵，據報道，NOP10的表達水平在腫瘤組織中顯著增加，是轉移形成的重要標誌物。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶是一種重要的酶，在細胞生長、增殖、代謝活性、存活和血管生成中發揮作用。涉及該酶的病理激活涉及多種機製，如腫瘤抑製基因的突變和失活。此外，PS組H2A.X免疫陽性率增加也是DNA損傷(shang) 的重要指標。在PS組中觀察到的神經元損傷(shang) 和JNK表達也可以被評估為(wei) 細胞凋亡增加的指標。氧化應激和隨後由於(yu) 抗氧化防禦係統不足而導致的自由氧物種增加所引起的不可逆損傷(shang) 將導致細胞凋亡增加。因此，根據全身免疫熒光幼魚染色的結果（圖2），在PNP組中觀察到的細胞死亡和自由氧自由基數量的顯著增加支持了這些發現。盡管這些不足以直接診斷癌症，但它們(men) 提供了支持癌症發現的重要初步信息。

圖4

至於(yu) 下調的代謝產(chan) 物，在PNP組中檢測到的低肌苷一磷酸（IMP）水平與(yu) 能量代謝失調有關(guan) ，可能解釋生長遲緩導致的眼睛大小、身體(ti) 長度和運動活性的差異。PNP組的亞(ya) 油酸、油酸和二十二碳六烯酸水平顯著較低。這些分子被稱為(wei) 不飽和脂肪酸（UFA），在細胞膜中發揮重要作用，用作能量儲(chu) 存，並參與(yu) 基因表達和蛋白質合成。膽固醇是脂質組織最重要的調節因子之一，是PNP組中另一種顯著下調的代謝產(chan) 物。當將這些發現與(yu) 全株免疫熒光幼魚染色分析的脂質積累結果一起評估時（圖2），我們(men) 可以說，親(qin) 代PNP暴露會(hui) 導致下一代脂質代謝惡化。

3.結論
父母接觸聚苯乙烯納米塑料會(hui) 導致下一代幼魚生長遲緩，包括畸形、存活率下降、心率和血流量增加，以及眼睛大小、身高和運動能力下降。根據全山免疫熒光幼魚染色的結果，注射PNP的斑馬魚新一代幼魚的細胞死亡和活性氧物種顯著增加，而脂質積累減少。根據代謝組學結果，檢測到了OPLS-DA分析提出的28個(ge) 注釋代謝組。此外，還發現新一代幼魚的組織病理學表現和JNK、H2A.X、PI3和NOP10的免疫陽性率顯著增加。總之，研究表明，即使僅(jin) 在胚胎期暴露於(yu) PS，也可能影響下一代許多與(yu) 癌症相關(guan) 的過程。

參考文獻
Sulukan E, Şenol O, Baran A, et al. Nano-sized polystyrene plastic particles affect many cancer-related biological processes even in the next generations; zebrafish modeling[J]. Science of The Total Environment, 2022, 838: 156391.


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