缺鐵（ID）是世界上普遍的營養(yang) 缺乏症。鐵被認為(wei) 是包括神經發育在內(nei) 的許多生物過程的必需元素。在懷孕期間，發育中的大腦特別容易受到環境損害，這可能會(hui) 不可逆轉地損害關(guan) 鍵的發育過程。雖然成年期慢性智力障礙導致的許多功能障礙可以通過補充鐵劑來逆轉，但胎兒(er) 時期的智力障礙對大腦結構和功能產(chan) 生持續影響。

在幾個(ge) 大腦區域中發現了胎兒(er) 缺鐵導致的改變，大量證據發現海馬體(ti) 的脆弱性，海馬體(ti) 是一個(ge) 在圍產(chan) 期具有高代謝需求和廣泛發育的區域。海馬體(ti) 在學習(xi) 和記憶中發揮著重要作用，其病理改變與(yu) 兒(er) 童早期智力缺陷後的認知缺陷密切相關(guan) 。

在這裏，我們(men) 設計了一個(ge) 小鼠模型來檢驗這樣一種假設，即妊娠期和哺乳期早期母體(ti) 飲食供應保持缺鐵性飲食，導致的胎兒(er) 和新生兒(er) 缺鐵與(yu) 成年後代抑鬱和焦慮樣行為(wei) 有關(guan) 。我們(men) 在模型中全麵描述了缺鐵的行為(wei) 後果，從(cong) 產(chan) 後早期對母親(qin) 行為(wei) 和小鼠超聲波發聲的評估，到成年後代的抑鬱和焦慮樣行為(wei) 。通過定義(yi) 其在成年海馬體(ti) 中的miRNA特征，揭示了早期生命缺鐵對大腦分子組成的長期影響。

研究方法
本研究采用了飲食鐵限製的小鼠模型，其中母鼠在整個(ge) 懷孕期間和哺乳早期接受缺鐵飲食 (IDD)，圖 1 A。在此背景下，我們(men) 決(jue) 定使用48ppm的飲食作為(wei) 邊際IDD，使用96ppm的飲食作為(wei) 鐵充足飲食 (ISD)對照，這樣可以評估妊娠缺鐵的長期後果，而不會(hui) 出現胎兒(er) 生長遲緩或母體(ti) 貧血的非特異性偏差。這相當於(yu) 孕婦每日膳食攝入13.5毫克鐵（比每天 27 毫克減少50%）。

圖1

產(chan) 婦護理行為(wei)
在PD1和PD6之間，每天上午11點至下午1點和下午3點至5點使用攝像頭記錄，每 3分鍾對行為(wei) 進行一次視頻評分，包括對幼鼠舔/梳理、築巢、護理和非幼鼠相關(guan) 參數（進食/睡眠、自我梳理）的評估。展示個(ge) 人行為(wei) 所花費的時間被描述為(wei) 總行為(wei) 活動的百分比（%）。

超聲波發聲
在PD4上，從(cong) 每窩中隨機選擇4隻幼崽來評估超聲波發聲 (USV) 叫聲。為(wei) 此，將幼鼠單獨放置在一個(ge) 裝有USB超聲波麥克風的隔音箱中3分鍾。使用諾達思的聲音行為(wei) 分析係統(UltraVox XT)對獲得的聲譜圖進行分析，以計算呼叫的數量和幅度。


聲音行為(wei) 分析係統(UltraVox XT)可以通過捕獲完整的聲譜，處理和分析齧齒動物的超聲波聲和其它動物的聲音。您可以在頻譜圖中直觀地選擇叫聲，並根據頻率、幅度、持續時間和時間間隔對類似的叫聲進行分類。您也可以將聲音數據輕鬆導出到動物運動軌跡跟蹤係統(EthoVision XT)和行為(wei) 觀察記錄分析係統(The Observer XT)中，與(yu) 其它行為(wei) 數據結合分析。


更多測試
本研究還會(hui) 進行蔗糖偏好測試、曠場測試、明暗箱試驗、旋轉測試、強迫遊泳測試、尾部懸掛測試、血液分析等測定，以及酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、大腦分析（普魯士藍染色、NeuN染色）、神經發生分析和miRNA測序。對於(yu) 許多測試中動物運動軌跡的追蹤可以使用動物運動軌跡跟蹤係統(EthoVision XT)來輕鬆實現。


動物運動軌跡跟蹤係統是應用於(yu) 跟蹤和分析任何動物的行為(wei) 、運動和活動研究的廣泛視頻跟蹤軟件。在研究魚類或昆蟲時，還可以結合兩(liang) 個(ge) 攝像機角度對實驗對象進行跟蹤，並結合三維軌跡跟蹤係統中的三維跟蹤項目實現三維追蹤。


結果
缺鐵不會(hui) 改變幼鼠出生前或出生後的生長，但會(hui) 降低腦鐵含量
我們(men) 首先確認，接受 IDD（48ppm FeSO4；n=38）和 ISD（96ppm FeSO4；n=43）的母親(qin) 在懷孕期間體(ti) 重增加沒有差異。此外，IDD 對每窩幼仔數量（圖 1，C）、每窩活幼仔百分比（圖 1，D）或其出生體(ti) 重（圖 1，E））沒有影響 ，證實 IDD 不會(hui) 導致宮內(nei) 生長遲緩/死亡或胎兒(er) 死亡。為(wei) 了防止由於(yu) 出生後大量生長期間鐵需求大幅增加而造成的生長偏差，所有動物在PD10時均轉為(wei) ISD。

在 PD11 對IDD和ISD後代的腦海馬切片測定非血紅素鐵（n = 6）。普魯士藍染色顯示 IDD 幼崽海馬體(ti) 中鐵含量顯著降低（圖 2（A，B））。使用神經元標記NeuN進行的免疫組織化學顯示，IDD和ISD後代的神經元密度具有可比性（圖 2，C），表明邊緣胎兒(er) ID不會(hui) 導致神經元丟(diu) 失或阻礙神經發生。

圖2

另外，成年IDD和ISD動物的海馬鐵含量沒有差異（圖2（D，E）），證實幼年期鐵儲(chu) 備的補充足以使腦鐵含量達到成年期的控製水平。

產(chan) 後護理行為(wei)
本研究通過產(chan) 後前六天的觀察評估了IDD和ISD母鼠的自發孕產(chan) 婦護理行為(wei) (n=6)，發現 IDD母親(qin) 舔舐和梳理幼崽的相對時間有選擇性和具體(ti) 的減少，但沒有其他幼崽指導（護理和築巢）或非幼崽指導的（自我梳理、睡眠、飲食）行為(wei) 表現（圖3（A，B））。

母性關(guan) 懷行為(wei) 是一種基於(yu) 母親(qin) 與(yu) 子女互動的社會(hui) 行為(wei) 形式。幼崽與(yu) 母親(qin) 的交流是通過幼崽超聲波發聲來進行的。然而，我們(men) 發現 IDD 幼崽的超聲波發聲沒有改變，IDD幼崽和ISD幼崽發出的超聲波叫聲的數量及其幅度相當（圖 3（C-E）），這表明在這個(ge) 發育階段，幼崽不太可能出現溝通障礙，並且IDD幼崽能夠有效地與(yu) 母親(qin) 互動。

圖3

生命早期的缺鐵持續擾亂(luan) 情感行為(wei)
本研究測試了具有胎兒(er) /新生兒(er) ID史的成年雌性和雄性動物（P90-P120；n=20-28），並在一組高度特定的行為(wei) 範式標準中測試了對照組：蔗糖偏好測試、強迫遊泳測試、懸尾測試、明暗箱、曠場測試。在所有測試中，一致發現胎兒(er) /新生兒(er) ID後動物的抑鬱和焦慮樣行為(wei) 有所增加。這反映在強迫遊泳和懸尾測試中的行為(wei) 絕望（不動）顯著增加（圖 4（A，B）），以及明暗箱中焦慮樣行為(wei) 增加（在明處中花費的時間減少）（圖 4，C））。在蔗糖偏好測試中，對蔗糖的偏好沒有顯著差異（圖4，D）。未發現成年IDD後代在開闊場地測試中的一般探索行為(wei) 和旋轉棒的運動活動發生變化（圖4（E，F）），排除了不具體(ti) 的表現偏差，並證實了專(zhuan) 門評估情感行為(wei) 的測試結果的相關(guan) 性。

圖4

缺鐵後成人海馬祖細胞增殖保持完整
在各種實驗模型係統以及人體(ti) 研究中，有大量證據支持成人海馬神經發生在抑鬱症和抗抑鬱治療反應中的作用。因此，我們(men) 開始使用5-Bromo-2 Deoxyuridine（BrdU）標記齒狀回中新生成的細胞來評估海馬祖細胞的增殖，來測試海馬神經發生的紊亂(luan) 是否與(yu) 胎兒(er) /新生兒(er) ID後小鼠的行為(wei) 缺陷有關(guan) （圖5，A）。我們(men) 發現IDD和ISD動物之間的新生細胞數量沒有差異（圖5（B，C）），並進一步證實NeuN免疫組織化學顯示的神經元總數在各組之間具有可比性（圖5，D）。

圖5

miRNA表達反映了早期生命缺鐵對大腦的長期影響
miRNA是基因表達的關(guan) 鍵調節因子，並參與(yu) 多種精神疾病的病理生理學。重要的是，鐵在 miRNA通路的活性中發揮著關(guan) 鍵作用。在此背景下，我們(men) 決(jue) 定在胎兒(er) ID 後對成年動物的海馬組織進行無偏miRNA測序。

經過多次測試的統計校正後，我們(men) 確定了IDD和ISD成年後代之間表達顯著差異的530個(ge) miRNA。與(yu) 對照組相比，在有早年ID史的動物海馬組織中，其中284個(ge) miRNA上調，246 個(ge) miRNA下調（圖 6，A）。

僅(jin) 考慮那些 log2 倍變化≥ +1.5 或≤−1.5 的miRNA，揭示了早期生命ID對同一家族的兩(liang) 個(ge) miRNA（miR 200a和miR 200b）的選擇性和特異性影響，這兩(liang) 個(ge) miRNA 均位於(yu) 小鼠 4 號染色體(ti) 上。靶基因預測揭示了miRNA 200a和miRNA 200b的253個(ge) 共享靶基因（圖 6，B）。對預測的共享目標的生物功能（圖6，C）的進一步生物信息學分析顯示，有大量顯著富集的基因集。

圖6

討論
在這項研究中，即使在懷孕和哺乳期間，鐵的供應量略有減少，也足以使胎兒(er) 大腦發育偏向於(yu) 對心理健康，特別是抑鬱症的不利後果。盡管大腦發育的主要部分發生在妊娠末期，但本研究設計在整個(ge) 妊娠期限製了飲食中的鐵攝入量，以更接近於(yu) 人類的情況。所提供的數據顯示，懷孕期間飲食鐵攝入量僅(jin) 減少50%，就會(hui) 降低幼年後代大腦的鐵含量，並對成年後代的情感行為(wei) 產(chan) 生長期影響，這是由抑鬱和焦慮樣行為(wei) 增加的表型特征定義(yi) 的，但對鐵儲(chu) 存和血清鐵指數沒有持續影響。

IDD母鼠的舔舐/理毛行為(wei) 水平低於(yu) 對照組，妊娠ID損害了自發的產(chan) 婦護理行為(wei) 。母親(qin) 的照顧行為(wei) 對後代的發育很重要，具體(ti) 而言，母親(qin) 的舔舐/梳理行為(wei) 是新生齧齒動物觸覺刺激的主要來源，可調節內(nei) 分泌、情緒和對壓力的認知反應的發展，因此會(hui) 增加患情感障礙（包括抑鬱症）的風險和焦慮症。不能排除IDD後代的行為(wei) 表型至少部分是由於(yu) 產(chan) 後早期接受的護理行為(wei) 減少的結果。

本研究結果揭示了成年IDD後代海馬組織中兩(liang) 種 miRNA（miR 200a 和 miR 200b）的特異性和選擇性失調。考慮到大量證據支持miRNA在大腦發育中的重要作用，以及關(guan) 於(yu) miRNA在控製行為(wei) 和情緒中的功能的新興(xing) 文獻，特別是在這種調節受損的精神疾病中，這一觀察結果是相關(guan) 的。miR 200a和miR 200b及其靶基因可能構成基因調控網絡，該網絡形成了早期生命ID對情感行為(wei) 影響的病理生理事件的分子基礎。

結論
總的來說，在懷孕和哺乳期間接受缺鐵性食物的母親(qin) 所孕育的幼崽腦鐵含量降低，母親(qin) 有明顯較少的舔舐和梳理行為(wei) 。有胎兒(er) 和新生兒(er) 缺鐵病史的成年後代表現出抑鬱和焦慮樣行為(wei) 的增加，同時海馬中的miRNA表達譜紊亂(luan) ，特別是miR200a和miR200b的水平。胎兒(er) 期和新生兒(er) 期的缺鐵對小鼠的情感行為(wei) 具有終身影響，並在大腦中的miRNA表達上留下了特定而持久的印記。胎兒(er) 和新生兒(er) 缺鐵需要進一步被視為(wei) 日後發展為(wei) 抑鬱症和焦慮症的風險因素。

參考文獻
Gundacker, Anna, et al. "Early-life iron deficiency persistently disrupts affective behaviour in mice." Annals of Medicine 55.1 (2023): 1265-1277.


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